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Bioss講堂|優化流式實驗的幾點建議
發表者:北京博奧森生物      發表時間:2019-5-31

為何優化流式實驗?

流式細胞術(FCM)工作流程中的所有步驟對獲取可發表的高品質圖像都至關重要。尤其是利用正確的抗體去識別抗原以及放大信號是實現最佳顯示的關鍵。每年不斷有高分文獻引用Bioss流式抗體。
在選擇好抗體,設置好對照之后結果仍不理想,可以從以下三方面考慮優化細節:



一、優化抗體使用濃

      圖1.為細胞對不同濃度的BMAL1(bs-3750R)、Jak3(bs-2808R)染色結果,可以看出抗體使用量不同時,陽性峰偏移程度有所不同。

圖1. 細胞對不同濃度的BMAL1(bs-3750R)、Jak3(bs-2808R)染色結果
抗體滴定方法
用同種細胞,相同細胞數量與反應體積,加入不同量的抗體計算陽性峰熒光強度及信噪比(S/N>3)。
1、滴定的濃度范圍盡量大,至少5個左右。
2、滴定實驗條件要和實際實驗條件一致,如反應溫度、pH等。
3、弱表達或不分群的抗原不適合做滴定。



二、排除死細

      如圖2.所示,死細胞的自發熒光水平很高,且容易攝取抗體導致非特異性結合,最終影響實驗結果;還可能會釋放DNA,DNA非常粘稠,會導致細胞成團,容易堵塞管路。

圖2. 全部細胞(All)與活細胞(Live)自發熒光區別

區分死細胞的方法
死細胞特性:細胞膜滲透性增強,失去膜完整性
? DNA結合染料: PI, DAPI, 7-AAD, TO-PRO-3等DNA染料只會進入細胞膜受損的細胞,結合到細胞的DNA上,圖3. 門R3中為7-AAD陰性,即為活細胞。

? 蛋白結合染料:結合細胞表面或膜內的游離胺,活細胞弱陽,死細胞強陽。可以用在固定標本中的,區分樣本固定細胞狀態。


圖3. 小鼠脾細胞7-AAD染色結果


、封閉Fc受體

     Fc受體是指細胞表面能夠與免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgE和IgD)結合的分子,存在于NK 細胞、肥大細胞、巨噬細胞、中性粒細胞的表面。FcR 能夠與抗體的Fc段結合,在檢測時產生假陽性,圖4. 為FcR 封閉前后陽性結果對比。

圖4. FcR封閉前后陽性峰對比
FC受體封閉試劑
? 商品化的 Fc Block試劑:重組人 IgG,小鼠 CD16/CD32 抗體。
? 人血清或相應物種的血清



四、Bioss檢測案例

圖5. 小鼠脾臟T cell、B cell分析



五、Bioss技術服務

     本服務項目主要是利用流式細胞儀和熒光標記抗體對客戶提供的細胞樣品或全血樣品進行檢測分析。可檢測的項目有:細胞周期檢測、細胞凋亡檢測、免疫細胞分型、細胞表面抗原鑒定、同城上機檢測。




六、流式抗體部分高分文獻

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